在经过N次的PCR、酶切、连接、转化之后，阳性率依旧很低，到底是哪一步出了问题？无缝克隆，一步法构建同源重组载体或许会解决你的实验难题。


无缝克隆（Seamless Cloning/In-Fusion Cloning），区别于传统PCR产物克隆，差异在于载体末端和引物末端应具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，进入宿主菌中的线性质粒（环状）依靠自身酶系将缺口修复。

无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。原理示意图如下：



图1. HB-infusion^TM 无缝克隆试剂原理示意图。1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR获取目的片段。设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp 的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion^TM 的2X预混液内，50℃ 反应20 min 后直接转化E.coli 即可。


操作步骤详解
1. 制备线性化载体和插入片段
1.1. 载体制备---线性化处理
A.质粒酶切法
在目标载体质粒上选取合适的位点进行单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。
注：1. 为了降低载体自连背景，提高阳性率，建议采用双酶切载体质粒。酶切最好
能切出一个较大片段，这样回收的目的条带可以和没有切开的质粒明显分开。
2. 质粒单酶切容易造成载体切割不完全和自连，导致假阳性的产生。因此，必须单酶切的时候建议延长酶切时间并脱磷处理（酶切2h-过夜，CIP 处理20 min），同时做好
空载的对照。
3. 请务必跑胶回收线性化的载体，否则非线性化质粒会带来极高的背景。
4. 一种特殊情况：如果采用双酶切彻底线性化载体，而插入片段又没有双酶切的
识别位点，也可以跳过纯化步骤，只需热失活内切酶即可用于下一步拼接反应。
B.质粒PCR 法


图2. PCR 法线性化载体示意图。在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行扩增，通过跑胶回收获取线性化载体片段。

选取合适的位点，设计正向和反向引物直接进行载体质粒的PCR 扩增，一般载体长度
均大于3 kb，建议采用高保真的DNA 聚合酶扩增。为了避免模板质粒DNA 对后续试验的影响，建议对PCR 扩增后的线性化载体进行割胶纯化，去除环状模板质粒，提高阳性率。

1.2. 目的插入片段制备
设计引物进行目的片段PCR 扩增，引物设计要保证目的片段两端有15~25 bp 序列与
线性化载体的两端一致（重叠序列的Tm48C，可以简单假设A-T 碱基对=2℃，G-C 碱基对=4℃）便于拼接反应的进行。PCR 引物包括5’端与载体同源的15~25 bp 以及目的片段特异性序列20~25bp（见下图3）。PCR 产物经跑胶纯化待用。


图3. 采用HB-infiusion^TM 试剂盒时PCR 上下游引物设计示例。针对双酶切法线性化载体设计插入片段的PCR 引物，其重叠区域为15~25 bp+酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保留此两个酶切位点。如果是PCR 法线性化载体，扩增插入片段的PCR引物5’端直接设计成与线性化载体末端15~25 bp 重叠即可。

2. 冰上融化并且充分混匀HB-infusion^TM Master mix，配制反应体系

3. 上述反应体系置于50℃孵育20 min（2-3 个片段拼接）/60 min（4-6 个片段拼接）。反应完成之后如不能马上进行后续操作可将反应样品暂储存于-20℃。
4. 转化感受态菌
4.1. 在冰上融化一支50 μl 的DH5a 感受态菌(配合汉恒生物专门为该试剂盒研制的感受态细胞，效果更佳)。
4.2. 取2 μl 第3 步中的反应样品加入融化好的感受态菌中，轻轻混匀，不能震荡混匀。将该混合物置于冰上30 min。
4.3. 轻轻摇匀后放入42℃水浴中1~2 min 进行热激，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
4.4. 在超净工作台中向上述各管中分别加入500 μl LB 培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h，摇床转速250 rpm。
4.5. 在超净工作台中取上述转化混合液100~300 μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB 平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。37℃培养箱中培养过夜。
4.6. 挑取平板上的克隆进行PCR 或者酶切鉴定。

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