哺乳细胞表达:CHO及HEK293优势及应用-技术前沿-资讯-生物在线

哺乳细胞表达:CHO及HEK293优势及应用

作者:北京同立海源生物科技有限公司 2022-10-14T17:22 (访问量:10112)


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现有的新型生物医药产品中,有相当多数量的生物制剂是通过重组细胞表达产生的,其中大部分蛋白质,均产生于哺乳动物表达平台。由哺乳动物细胞产生的外源蛋白在活性方面远胜于原核细胞表达系统,因此哺乳动物细胞作为宿主,被广泛应用于生物制药的工业化生产中。近年来除了生物制剂的生产系统已大幅度转向哺乳动物细胞表达系统外,越来越多科学家把关注点转移到哺乳动物细胞翻译后修饰与生物制剂的活性,并针对其关联性展开了大量的研究工作。


01、哺乳细胞表达分类


根据国际人用药品注册技术协调会(International Council for Harmonization, ICH)Q5D《用于生物技术产品及生物制品生产的细胞基质的来源和鉴定》中要求“对于重组产品,细胞系是指克隆自一个祖细胞且含有所需序列的转染细胞”[1]。


哺乳动物细胞是表达人类基因的系统,其优点是能够促进蛋白质正确折叠,提供准确的糖基化、乙酰化等多种翻译后修饰。它能通过构建信号肽使成熟的蛋白分泌到胞外,利用亲和纯化的方式,比较轻松地获得高活性的蛋白[2]。基于哺乳动物细胞表达系统制备的重组蛋白,其高级结构、翻译后修饰、理化性质、生物化学活性更接近天然的高等生物蛋白质分子,被大量用于治疗性重组蛋白的生产。根据目的蛋白表达的时空差异,可将哺乳动物细胞表达系统分为瞬时、稳定和诱导表达系统[3]。


●瞬时表达系统


宿主细胞在导入表达载体后不经选择培养,载体DNA随细胞分裂而逐渐丢失,目的蛋白的表达时间较短。相对于稳定表达系统,瞬时表达系统无需将外源基因整合到基因组上,避免了外源基因整合过程中位置效应的影响。


优点:表达周期短,表达量高等。

缺点:技术条件要求高,如质粒的纯度、转染的效率等。


●稳定表达系统


载体导入宿主细胞后,目的基因整合到细胞基因组上,不会随着细胞传代而消失,能够长期稳定的生产目的蛋白。


优点:目的蛋白表达持久、稳定。

缺点:由于需要抗性选择甚至加压扩增等步骤,稳定表达相对耗时耗力。


●诱导表达系统


目的基因的转录受外源小分子的诱导,可在特定的时间或特定的组织、细胞类型内表达,经诱导后目的基因的表达可大大提高。目前,基于四环素或多西环素的调节系统以及雌激素受体他莫昔芬系统应用较为广泛。参与诱导调控的因子与细胞内源性的因子间无相互作用,因此一方面目的基因的表达本身不受细胞内环境改变的影响,另一方面诱导药物对内源基因的表达无作用,因而具有很好的严谨性和特异性。


02 、基于哺乳细胞表达的细胞特点


由于哺乳动物细胞表达的细胞需要稳定持续生长,并且能够通过外源基因导入以实现目的基因的表达,需要动物组织通过层层筛选、培养优化获得。常用的细胞系包括HEK293(人胚肾细胞)和CHO(中国仓鼠卵巢细胞)这两种细胞;均采用悬浮细胞培养,可以在一个月内产生数克级蛋白[4]。


然而哺乳动物表达系统也存在着一定的劣势,比如实验成本高、表达周期长、技术难度高等。哺乳动物细胞表达重组蛋白的最大问题是转染效率不高及所表达的蛋白质水平较低。但随着如今科研水平的进步,HEK293细胞及CHO细胞已被分别开发为有效的瞬时和稳定表达系统。


以脂质体、磷酸钙或PEI作为转染试剂进行瞬时转染,HEK293细胞被广泛用于生产蛋白、疫苗、抗癌试剂及重组腺病毒包被等。HEK293瞬时表达相对简单和容易,但扩大规模却在技术上充满挑战,而CHO细胞通常用于稳定制备大量重组蛋白。


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HEK293细胞和CHO细胞是在真核蛋白表达系统中最常用的细胞,具有以下特点:

①具有准确的翻译后修饰功能,表达蛋白在任何方面都最接近天然状态;

②具有重组基因的高效扩增和表达能力;

③具有较高的耐受剪切力和渗透压能力,表达水平较高;

④CHO属于成纤维细胞,是一种非分泌细胞,自身很少分泌内源蛋白,有利于目的蛋白的分离纯化;

⑤HEK293细胞具有更高的生长密度和更快的生长速度优势,易培养,易转染。


HEK293作为一款全能细胞,在病毒生产和重组蛋白生产中有着举足轻重的地位。但现阶段科研实验中,最常用的生物药学蛋白制备宿主却是CHO。在所有哺乳动物细胞表达系统中目前有70%的重组蛋白生物制剂源自于CHO,小鼠骨髓淋巴瘤细胞(NS0和Sp2/0)已获批用于西妥昔单抗(cetuximab)和帕利珠单抗(palivizumab)等抗体的商业化生产,人胚肾细胞HEK293已获批用于凝血因子Fc融合蛋白商业化生产[5]。


CHO如此受欢迎,原因是其拥有极高的生产力(批量培养0.1-1g/L,分批培养1-10g/L),并且表现出持续良好的生长表型,适合大规模工业化培养,容易适应各种化学成分限定的培养基,不易被人类病毒感染,能够进行人类兼容的糖基化等诸多优点。


统计数据显示,近十年中有超过一百多种市场价值预计达1400亿美元的生物制药产品在美国和欧盟获得批准并销售。这些获批销售的产品有很大一部分是重组蛋白,其中使用哺乳动物表达平台的比例在不断增加。2016-2020年,有超过 80% 在美国和欧洲市场获批的重组蛋白生物药物是通过培养的哺乳动物细胞生产的。2018 年十大畅销药物(包括传统药物和生物药)中有8种是在培养的哺乳动物细胞中生产的重组蛋白。


03 、真核哺乳细胞应用


CHO细胞:基于哺乳动物细胞的早期生物药

1987 年中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞源性的组织纤溶酶原激活剂 (Activase®) 获批用于治疗心肌梗塞,开启了利用哺乳动物细胞表达系统生产生物药的时代。在过去的几十年里,用于生产生物药的哺乳动物细胞表达系统中,CHO 细胞已成为生物制药行业的主力。从 1987 年到2021年2月,通过培养的哺乳动物细胞生产的获批生物药中有 81% 是使用CHO细胞生产。


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1987年至2021年2月用于生物药商业规模生产的哺乳动物细胞系类型百分比。


抗体相关生物药

1987年至2021年期间,欧盟和美国共批准了超过 207 种哺乳动物细胞源性生物药[6]。在这类获批的哺乳动物细胞源性生物药中,单克隆抗体已成为生物制药市场的重要推动力,成为增长最快的创新点和收入来源。已获批准的四种主要抗体类型是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和完全人源抗体。


由培养的哺乳动物细胞生产的生物药包括激素、酶、细胞因子、凝血因子、Fc融合蛋白和抗体。从1987年到2021年2月批准的大多数基于哺乳动物细胞的生物药是抗体,在生物制药市场中约占58%。其中,嵌合、人源化和全人源单克隆抗体三大类构成了约98%的抗体产品。


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HEK293细胞:重组治疗性蛋白和疫苗的生产

Drotrec-ogin alfa (Xigris®)是第一个基于HEK293细胞系生产的重组治疗性蛋白质,并在2001年获得批准,2002年被FDA和EMA批准用于治疗脓毒症患者。随后,美国和欧盟批准了4种基于HEK293细胞生产的药物,包括Efmoroctocog alfa (Eloctate®)、Human-cl rhFVIII (Nuwiq®)、 Eftrnonacog alfa (Alprolix®)、Dulaglutide (TrulicityTM)。


HEK293细胞还被用于制造腺病毒疫苗,用于基因治疗、预防接种和癌症治疗。作为首个基因治疗药物,Recombinant human AdV-p53 (Gendicine)于2003年获得CFDA批准,用于联合化疗治疗头颈部鳞状细胞癌患者。此外,2010年完成了在HEK293细胞中生产的MRKAd5HIV-1gag/pol/nef疫苗(ClinicalTrials.gov,NCT00849680)和VRC-HIVADV014-00-VP疫苗(ClinicalTrials.gov,NCT00119873)的临床试验。


基因工程重组蛋白药物是新药开发的重要发展方向之一,如今重组蛋白药物虽然仅占全球处方药市场的7%-8%,但其发展速度不可小觑。1989年重组蛋白药物的销售额为47亿美元,到2005年达到410亿美元,几乎是1989年的9倍。其中排名前10位的药物占销售额的60%以上,血液病、肿瘤、中枢神经系统疾病及感染疾病(如艾滋病等)药物占据重组蛋白药物市场绝大部分份额。


十九世纪八十年代中期,自从重组哺乳动物细胞系第一次被报道,细胞系的构建得到了快速的发展。未来科研人员对重组蛋白生产的研究,有望在重组蛋白药物开发方面取得快速进展,使得我们获得更可行、更高效的重组蛋白类生物药物。虽然重组蛋白药物生产条件严苛,服用流程复杂且价格昂贵,但对于某些疾病却有着不可替代的治疗作用。未来中国生物制药领域仍将以重组蛋白为主流,这与世界生物制药领域的发展趋势吻合,相信哺乳动物细胞将在重组蛋白药物研制过程中发挥更重要的作用。


同立海源生物具备十余年中试工艺生产经验,拥有哺乳动物细胞表达蛋白质工程平台,公司生产的真核重组蛋白产品具有翻译后修饰功能,更好的维持了天然蛋白构相、活性更高、效果更好、稳定性强,同时满足客户个性化定制服务需求。制药级生产车间及药用包材,保障了产品高性能和高稳定性,支持细胞药物临床申报,助力生物制品制造。

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参考文献:


[1] International Council for Harmonisation. Q5D: derivation and characterisation of cell substrates used for production of biotechnological/biological products [EB/OL]. Switzerland: ICH, 1997 [2018-12-31].https://www.ich.org/page/quality-guidelines.


[2] Gray D. Overview of protein expression by mammalian cells. Curr Protoc Protein Sci. 2001 May;Chapter 5(1):Unit5.9. doi: 10.1002/0471140864.ps0509s10. PMID: 18429190; PMCID: PMC7162368.


[3] Hacker DL, Balasubramanian S. Recombinant protein production from stable mammalian cell lines and pools. Curr Opin Struct Biol. 2016 Jun;38:129-36. doi: 10.1016/j.sbi.2016.06.005. Epub 2016 Jun 17. PMID: 27322762.


[4] Tihanyi B, Nyitray L. Recent advances in CHO cell line development for recombinant protein production. Drug Discov Today Technol. 2020 Dec;38:25-34. doi: 10.1016/j.ddtec.2021.02.003. Epub 2021 Apr 12. PMID: 34895638.


[5] Hu J, Han J, Li H, et al. Human Embryonic Kidney 293 Cells: A Vehicle for Biopharmaceutical Manufacturing, Structural Biology, and Electrophysiology. Cells Tissues Organs. 2018;205(1):1-8. doi: 10.1159/000485501. Epub 2018 Feb 1. PMID: 29393161.


[6] R.Al-Majmaie, D.Kuyestermans, M.Al-Rubeai, Biopharmaceuticals Produced from Cultivated Mammalian Cells. Cell Culture Engineering and Technology, Cell Engineering 10, 2021.


关于同立海源


北京同立海源生物科技有限公司,成立十余年专注细胞和基因治疗(CGT)上游GMP级原料试剂研发,致力于为生命科学提供可靠的产品与服务。产品涉及真核重组蛋白、细胞分选试剂、无血清培养基、细胞培养试剂盒、工具酶。为细胞和基因治疗、mRNA开发、抗体药物开发、细胞储存等生物制药和IVD领域提供核心原料试剂与服务。


公司建有符合cGMP标准的万级洁净车间,包括哺乳动物细胞表达蛋白质工程平台、细胞培养技术开发平台、体外诊断试剂生产平台,通过ISO13485和ISO9001双认证,部分产品已获美国FDA DMF备案。

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